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南京凱基生物科技發展有限公司

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凱基Annexin V-EGFP細胞凋亡檢測試劑盒(KGA101/KGA102/KGA103/KGA1)

凱基Annexin V-EGFP細胞凋亡檢測試劑盒(KGA101/KGA102/KGA103/KGA1)

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產品參數

型號: KGA101/KGA102/KGA103/KGA1 規格: 10次、20次、50次、100次

產品詳情

  一、原理
  在正常細胞中,磷脂醯絲氨酸(PS)只分佈在細胞膜脂質雙層的內側,而在細胞凋亡早期,細胞膜中的磷脂醯絲氨酸(PS)由脂膜內側翻向外側。Annexin V是一種分子量爲35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白,與磷脂醯絲氨酸有高度親和力,故可通過細胞外側暴露的磷脂醯絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V被作爲檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。將Annexin V進行熒光素(EGFP、FITC)標記,以標記了的Annexin V作爲熒光探針,利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發生。與FITC的綠色熒光信號相比,EGFP的綠色熒光信號具有信號強,不易淬滅,穩定性高等優點,故本試劑盒採用EGFP作爲熒游標記探針。碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一種覈酸染料,它不能透過完整的細胞膜,但對凋亡中晚期的細胞和死細胞,PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用,就可以將處於不同凋亡時期的細胞區分開來。
  
  二、試劑盒組份
  組份  Cat: KGA101
  10 assays  Cat: KGA102
  20 assays  Cat: KGA103
  50 assays  Cat: KGA104
  100 assays
  Annexin V-EGFP  50μL  100μL  250μL  500μL
  Binding Buffer  5.0 mL  10 mL  25 mL  25 mL×2
  Propidium Iodide (PI) 50μL  100μL  250μL  500μL
  
  三、操作步驟
  1、懸浮細胞離心(2000rpm離心5min)收集;貼壁細胞用不含EDTA的胰酶消化收集(注:胰酶消化時間不易過長,否則容易引起假陽性);
  2、用PBS洗滌細胞二次(2000rpm離心5min)收集1~5×105細胞;
  3、加入500μL的Binding Buffer懸浮細胞;
  4、加入5μL Annexin V-EGFP混勻後,加入5 μL Propidium Iodide,混勻;
  5、室溫、避光、反應5~15min;
  6、請在1 hour內,進行下述熒光顯微鏡或流式細胞儀的觀察和檢測。
  A、熒光顯微鏡觀察
  1、滴一滴上述染色後的細胞懸液於載玻片上,並用蓋玻片蓋上細胞;
  2、對於貼壁細胞來說,也可直接用蓋玻片來培養細胞並誘導細胞凋亡;
  (1)  將細胞於蓋玻片上生長,用適當的凋亡誘導劑誘導細胞凋亡,並設立陰性對照組;
  (2)  用PBS洗滌細胞兩次;
  (3)  在500μL的Binding Buffer中加入2μL Annexin V-EGFP,5 μL Propidium Iodide,混勻;
  (4)  將上述溶液滴加於蓋玻片表面,使長有細胞的蓋玻片表面均勻覆蓋;
  (5)  避光、室溫反應5 min。
  3、將蓋玻片倒置於載玻片上,於熒光顯微鏡下、雙色濾光片(FITC和羅丹明)觀察
  Annexin V-EGFP熒光信號呈綠色,PI熒光信號呈紅色。
  B、流式細胞儀分析
  用流式細胞儀檢測,激發波長Ex=488 nm;發射波長Em=530 nm。
  Annexin V-EGFP的綠色熒光通過FITC通道(FL1)檢測;PI紅色熒光通過PI通道(FL2或FL3)檢測,建議使用FL3。
  熒光補償調節:使用未經凋亡誘導處理的正常細胞,作爲對照進行熒光補償調節去除光譜重疊和設定十字門的位置。
  
  四、注意事項
  1、Annexin V-EGFP,Propidium Iodide (PI)避光儲存及使用。
  2、Propidium Iodide (PI)有毒,操作時要戴手套。
  3、本試劑盒適用於檢測活細胞,流式細胞儀檢測時,細胞數量不以應低於1×105,不適用於檢測組織樣本。
  4、推薦使用懸浮培養細胞,如果是貼壁細胞,用胰酶消化不當,會引起假陽性,而用細胞刮子會造成細胞粘連成團,而影響檢測。可將胰酶消化後細胞的儲存在含2%BSA的PBS中,防止進一步的損傷。
  5、因檢測細胞的類型、凋亡誘導劑種類、使用的檢測儀器不同,因而流式檢測的熒光補償也不同,因此建議每次檢測均需使用未經凋亡誘導處理的細胞作爲對照,進行熒光補償的調節。
  
  五、儲存 置於4ºC,可儲存一年